Xây dựng phương pháp xác định Locus Gen phục vụ cho công tác thử nghiệm và giám định Gen ở cây lúa theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017
ISO/IEC 17025:2017 (International Organization for Standardization/ International Electrotechnical Commission) là phiên bản mới nhất của Tiêu chuẩn quốc tế về hệ thống quản lý chất lượng áp dụng riêng cho phòng thử nghiệm/hiệu chuẩn (Honsa and McIntyre, 2003).
Đây là tiêu chuẩn cứng, điều kiện bắt buộc được đưa ra cho phòng thử nghiệm/hiệu chuẩn nhằm đảm bảo kết quả đo lường/thử nghiệm đạt được kết quả tin cậy nhất và được quốc tế công nhận. Vì thế, ISO/IEC 17025:2017 được xem là mục tiêu cần hướng đến và đạt được của các phòng thí nghiệm trong nước hiện nay. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong tích hợp gen (locus gen) mục tiêu nhằm cải tiến tính trạng mong muốn của các giống lúa đại trà là cách tiếp cận tối ưu, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả chọn tạo giống (Lê Hùng Lĩnh và ctv., 2017). Từ đó, một số giống lúa cải tiến đã được ra đời, với việc tích hợp gen kháng bệnh và chống chịu bất lợi phi sinh học. Do vậy, xác định chính xác sự có mặt của gen (locus gen) mục tiêu trong dòng/giống lúa được xem là yêu cầu cấp bách trong thời gian tới. Trong nghiên cứu này, phương pháp xác định 10 gen (locus gen) mục tiêu, bao gồm ba gen kháng bệnh bạc lá xa5, Xa7 và Xa21; bốn gen kháng bệnh đạo ôn Pik-h, Piz-5, Pita-2 và Pi9(t); locus gen chịu ngập Sub1; locus gen chịu mặn Saltol và gen qui định mùi thơm fgr ở lúa được thiết lập nhằm áp dụng cho Phòng Sinh học phân tử giám định gen thực vật theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017.
Nghiên cứu do Nhóm tác giả gồm: Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Chu Đức Hà, Nguyễn Thị Nhài, Nguyễn Bá Ngọc, Khuất Thị Mai Lương, Phạm Thị Lý Thu, Lê Hùng Lĩnh (Viện Di truyền Nông nghiệp, VAAS) nghiên cứu được thực hiện từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2018 tại phòng Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp.
Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu giống lúa cần thử nghiệm được nhân viên phòng giám định thu thập trên đồng ruộng hoặc do khách hàng cung cấp được mô tả như trong nghiên cứu trước đây (Chu Đức Hà và ctv., 2018). Mẫu thử nghiệm phải có lai lịch giống rõ ràng, được lai tạo từ giống chuẩn cho gen (giống đực) (IRRI cung cấp) và giống gốc (giống cái).
- Nghiên cứu này sử dụng các mẫu giống chuẩn mang gen/ locus gen mục tiêu và các giống chuẩn không mang gen do Viện Lúa Quốc tế cung cấp cùng với các giống tham khảo BT7, BC15 và Khang dân 18... để hoàn thiện phương pháp xác định các locus gen, xây dựng quy trình (Bảng 1). Các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen (locus gen) mục tiêu được khai thác trong nghiên cứu trước đây (Bảng 2).
Nghiên cứu sử dụng các phương pháp: phương pháp lấy mẫy, phương pháp tách chiết ADN tổng số, phương pháp khuếch đại bằng phản ứng PCR, phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose:
- Phương pháp lấy mẫu: Mẫu giống được thu thập và bảo quản dựa trên phương pháp lấy mẫu lúa theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017 của phòng thử nghiệm theo mô tả trong nghiên cứu trước đây (Chu Đức Hà và ctv., 2018).
- Phương pháp tách chiết ADN tổng số: Mẫu lá thử nghiệm được tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) (Semagn, 2014). Chất lượng của ADN được kiểm tra trên hệ thống máy đọc quang phổ SpectroMAX 190 (Molecular Devices, Hoa Kỳ).
- Phương pháp khuếch đại bằng phản ứng PCR: Mẫu ADN pha loãng đến nồng độ 30 ng/µl được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR trên máy C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-rad, Hoa Kỳ) (Rahman et al., 2013).
- Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose: Sản phẩm PCR được tiến hành điện di trên gel agarose 2,5% có bổ sung thuốc nhuộm safeview ADN với dung dịch đệm TBE 0,5Χ (Tris base, boric acid, EDTA) (Kumar et al., 2015).
Qua kết quả nghiên cứu đã xác định chỉ thị RM153 liên kết xa5, P3 liên kết Xa7, pTA248 liên kết Xa21, RM224 liên kết Pik-h, pB8 liên kết Pi9(t), RM527 liên kết Piz-5, RM7102 liên kết Pita-2, ART5 liên kết locus gen Sub1, RM493 liên kết locus gen Saltol và BAD2 liên kết fgr phù hợp cho thử nghiệm 10 chỉ tiêu gen kháng bệnh và chống chịu bất lợi phi sinh học. Đã thiết lập được phương pháp xác định locus gen mục tiêu phục vụ thử nghiệm và giám định gen thực vật theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017. Quy trình gồn bốn bước chính, tách chiết ADN tổng số, khuếch đại gen (locus gen) bằng PCR, kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose và phân tích kết quả. Kết quả phân tích 100 cá thể ngẫu nhiên cho phép đưa ra nhận định về sự có mặt/ vắng mặt của gen mục tiêu trong mẫu giống thử nghiệm và tỷ lệ cá thể mang gen (%) trong lô mẫu đưa vào thử nghiệm.
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(100)/2019